皮膚致敏(Skin sensitization)即皮膚接觸過敏原后所產(chǎn)生的變應(yīng)性應(yīng)答，是一種由外源物質(zhì)引發(fā)的IV型過敏反應(yīng)。過敏性接觸性皮炎(Allergic contact dermatitis，ACD)作為皮膚致敏的臨床表型，在人群中發(fā)生率高達(dá)15%~20%。因此，皮膚致敏性評價是化學(xué)品毒性評價的重要內(nèi)容之一。

毒理試驗(yàn)中心-皮膚致敏試驗(yàn)替代方法有哪些

皮膚致敏試驗(yàn)替代方法有哪些

小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)（LLNA）

目前，普遍認(rèn)為LLNA和豚鼠最大值試驗(yàn)仍是皮膚致敏性體內(nèi)評價實(shí)驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)。豚鼠最大值試驗(yàn)通過觀察皮膚反應(yīng)而進(jìn)行定性檢測，而LLNA則依據(jù)淋巴細(xì)胞的增殖對受試物致敏性進(jìn)行評價。皮膚致敏劑可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖，通過氚化胸腺嘧啶脫氧核苷標(biāo)記法、ATP生物發(fā)光法或BrdU酶聯(lián)免疫法可檢測淋巴細(xì)胞增殖。LLNA在一定程度上可減少動物使用和提升動物福利水平。此外，LLNA不能很好地區(qū)分致敏物和刺激物，且可能出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。

KeratinoSensTM/LuSens試驗(yàn)

研究表明Keap1(Kelch-like ECH-associatedprotein1)是抗氧化應(yīng)答的主調(diào)控因子，并可與Nrf2(Nuclear factor(erythroid-derived2)-like2)相互作用，其對改善氧化應(yīng)激至關(guān)重要。Keap1從轉(zhuǎn)錄因子Nrf2上解離，Nrf2隨后在核內(nèi)聚集，并激活啟動子序列中具有ARE(Antioxidant Response Elements)的基因。

很多響應(yīng)致敏劑作用的細(xì)胞標(biāo)志物由Keap1-Nrf2-ARE通路所調(diào)控[。基于上述理論，研究人員開發(fā)出了KeratinoSensTM和LuSens兩種定量測試方法。KeratinoSenTM和LuSens的主要區(qū)別在于ARE元件來源，前者源于人AKR1C2(Aldo-ketoreductasefamily1member C2)基因，后者源自大鼠NQ01(NAD(P)H quinone dehydrogenase1)基因。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(0rganization for Economic Cooperation and Development，0ECD)指南指出KeratinoSensTM試驗(yàn)的陰性結(jié)果可能存疑，因?yàn)槭茉囄锶暨x擇性與賴氨酸殘基反應(yīng)也可被評估為非致敏物[2.KeratinoSensTM/LuSens試驗(yàn)也可能出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果，并且對含酐的待測物預(yù)測存在困難。

h-CLAT/U-SENS(Myeloid U937 skinsensitisation test)試驗(yàn)

b-CLAT/U-SENS試驗(yàn)主要利用皮膚致敏有害結(jié)局通路KE3(Keyevent3)：樹突狀細(xì)胞可與過敏原相互作用，攝取并呈遞過敏原表位至T淋巴細(xì)胞。而樹突狀細(xì)胞或單核細(xì)胞激活后其細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86或CD54會發(fā)生相應(yīng)表達(dá)變化。h-CLAT是將待測物暴露于人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1.通過檢測細(xì)胞CD86和CD54的表達(dá)變化評估待測物的致敏性。與之類似U-SENS將受試物暴露于人淋巴癌細(xì)胞系U937并檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86的變化。h-CLAT高度簡化，但其對角質(zhì)化細(xì)胞缺乏作用，此外因其靈敏度低，對弱致敏劑預(yù)測較差。h-CLAT采用流式細(xì)胞術(shù)檢測，因而可能帶來熒光干擾和待測物的細(xì)胞毒性干擾。

重組人表皮致敏試驗(yàn)

三維重組人表皮模型(RHE模型)由人源性表皮角質(zhì)細(xì)胞組成，該模型于氣-液界面培養(yǎng)，因而可直接應(yīng)用于化學(xué)品。據(jù)文獻(xiàn)報道，RHE模型呈現(xiàn)出與人皮膚類似的代謝能力，這提示RHE模型可代謝pre/pro-半抗原(pre/pro-hapten)，并用于評估相關(guān)化學(xué)品。SenCeeTox主要監(jiān)測8個Nrf2依賴基因，而SENS-IS則關(guān)注24個Nrf2-依賴基因和41個其他靶標(biāo)基因。SENS-IS則通過65個靶標(biāo)檢測炎癥和細(xì)胞保護(hù)應(yīng)答，在對150個化學(xué)品測試中，與LLNA相比準(zhǔn)確度達(dá)到100%。

EpiSensA則基于炎癥和細(xì)胞保護(hù)相關(guān)基因ATF3(Activating transcription factor 3)、1L-8、DNAJB4( DnaJ homolog subfamily B member 4)和GCLM( Clutamate-cysteine ligase modifier subunit )等進(jìn)行檢測。

EpiSensA與LLNA相比，在29個親脂性化學(xué)品測試中，其靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度分別達(dá)到93%，100%和93%;另外在43個親水性化學(xué)品測試中(含11個pre/pro-半抗原)，其靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度分別達(dá)96%，75%和88%。

直接肽反應(yīng)試驗(yàn)（DRPA）

2004年，Gerberick等提出直接肽反應(yīng)試驗(yàn)該法將待測物與賴氨酸多肽孵育后，采用HPLC-UV檢測未與待測物共價結(jié)合的多肽。而后Gerberick等開發(fā)了一套基于多肽損耗和LLNA數(shù)據(jù)的預(yù)測模型，并采用庫珀統(tǒng)計(jì)法評估模型對致敏物的區(qū)分程度。研究表明，賴氨酸多肽1：50模型在多肽比率方面平衡較好，預(yù)測準(zhǔn)確度達(dá)89%(81個待測物)。經(jīng)過兩輪實(shí)驗(yàn)室對比驗(yàn)證，結(jié)果表明其重現(xiàn)性良好。研究人員將辣根過氧化物酶-過氧化氫( Horseradish Peroxidase and Hydrogen Peroxide， HRP/P)加入多肽孵育體系后，使得DPRA可檢測需酶介導(dǎo)激活的pro-半抗原，從而進(jìn)一步拓展了DPRA的應(yīng)用范圍。

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